"Microscopia y niveles de organización celular"
Introducción
Todos los seres vivientes están constituidos por células, en algunos casos una sola célula conforma un organismo completo (unicelulares), en otros más complejos muchas células se han organizado para constituir un organismo (pluricelulares). Lo anterior ha llevado a la especialización celular para la realización de variadas funciones, producto de lo cual, es posible observar una muy amplia diversidad celular. Así por ejemplo, existen múltiples formas y tamaños celulares, como también, diferentes niveles de organización:
i)los procariontes de una organización estructural simple, no presentan compartimentos intracelulares. El DNA se encuentra disperso en el citoplasma ocupando una posición mas o menos central;
ii) los eucariontes, en cambio presentan una mayor complejidad, poseen compartimentalizaciones y han desarrollado una multiplicidad de estructuras membranosas adaptadas para realizar funciones específicas denominadas organelos. El material genético se encuentra en un compartimento denominado núcleo.
El estudio de la estructura y funciones celulares ha experimentado tres períodos fundamentales de progreso. El primer periodo se inicia a comienzos del siglo XVII y se caracteriza por el descubrimiento de un mundo diminuto, no detectable por el ojo humano pero sí por lupas o lentes. Las primeras observaciones fueron de glóbulos rojos sanguíneos por Fierre Borel en 1656. En 1665, Robert Hooke introdujo el término célula para describir la estructura del corcho y en 1674, Antón van Leeuwenhoek observó organismos unicelulares vivos. Al paso de los años, los lentes se perfeccionaron y transformaron en microscopios ópticos. En 1838-1839, Mathias Jacob Scheiden y Theodor Schwann formularon la teoría celular, que considera a la célula como una unidad estructural común de todos los seres vivientes, y que una célula madre es capaz de dividirse en dos células hijas. Esto último fue un aporte hecho por Rudolph Virchow en 1858. Ya a fines del siglo XIX se dispuso de tinción y fijación de los tejidos que permitieron una enorme recopilación de detalles celulares como la división celular y la fecundación celular. Los fenómenos de evolución y herencia empezaron a tener gran importancia. El segundo período, comienza a fines del siglo XIX y se caracteriza por la tentativa de interpretar las estructuras celulares con respecto a su función. El tercer período en cambio, acentúa el conocimiento de la función de lo componentes celulares a nivel molecular.
El microscopio es sin duda el elemento más importante para el estudio de la morfología celular. El tipo de microscopio más utilizado es el microscopio óptico, que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. El microscopio óptico más simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios ópticos pueden aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces, lo que resulta de gran utilidad considerando, por ejemplo, que una célula animal típica mide entre 10 y 20 μm de diámetro. El microscopio compuesto puede dividirse en:
i) Sistema mecánico; conformado por:
a) El pie o base de sustentación.
b) El brazo o columna.
c) La platina; que consiste en una plataforma horizontal con un orificio central por donde pasa la luz. Es aquí donde se ubica la preparación en un carro móvil que permite desplazarla.
d) El tubo; es un cilindro metálico que lleva en el extremo próximo al observador el ocular y el revólver en el extremo opuesto.
e) El revólver es una pieza giratoria que posee diferentes lentes objetivos, cada uno de ellos posee un aumento distinto. Al girar esta pieza es posible utilizar estos lentes para la observación.
f) Los tornillos de focalización; el enfoque se realiza modificado la distancia entre la preparación y el objetivo. El ajuste se realiza con dos tornillos; el macrométrico que se usa para los ajustes gruesos y el micrométrico para el ajuste fino o de precisión. Este último tiene una escala graduada, en donde cada marca representa un avance de dos micrones.
ii) Sistema óptico está compuesto por:
a) La fuente luminosa que se ubica bajo el condensador.
b) El condensador consiste en un sistema de lentes que concentra la luz en la preparación. Posee un tornillo de control que permite mover este dispositivo.
c) El diafragma o iris; se localiza en el condensador y permite regular la cantidad de luz que sale de este.
d) Anillo porta filtro; permite colocar un filtro de color anexo al condensador para destacar alguna estructura de interés en la preparación.
e) Lentes oculares; se encuentran en la parte superior del tubo, por lo general tienen un aumento de 8X, 10X ó 12X. Los oculares están formados generalmente por un sistema de dos lentes plano convexas simples o compuestas, separadas por un diafragma interno. El lente inferior se denomina "lente de campo" y tiene por función recoger la mayor cantidad de rayos divergentes que vienen del objetivo. Tiene su foco en el diafragma y ahí la imagen es aumentada por el lente superior.
f) Lentes objetivos; se encuentran montadas en el revólver que permite su intercambio durante la observación. Las diferentes lentes están marcadas con su aumento y la apertura numérica, vale decir el lente tiene la marca 10:1:AN 0.25 significa que ese objetivo tiene un aumento de 10, siendo su apertura numérica 0.25. La lupa u objetivo menor tiene un aumento de 4X, los otros generalmente son 10X, 40X y 100X.
En ocasiones también se habla de "objetivos a seco" y de "objetivos de inmersión", haciendo referencia a lo que se encuentra entre la preparación y el objetivo. Así el objetivo a seco se refiere a que entre la preparación la lente existe aire, mientras que los objetivos de inmersión requieren que exista entre la lente y la preparación una sustancia conocida como aceite de inmersión.
Microscopios especiales
Varias propiedades ópticas pueden utilizarse en combinación con un microscopio. Nos referiremos al microscopio de campo oscuro, contraste de fases, fluorescencia y al microscopio electrónico.
Microscopio de campo oscuro
Se basa en la propiedad que tienen los objetos muy pequeños del orden de la longitud de onda de la luz (o el borde de algunos objetos microscópicos tales como membranas celulares o de organelos) de dispersar la luz, o sea el rayo de luz se “quiebra” al pasar por ellos. Si iluminamos oblicuamente el objeto en tal forma que el rayo de luz no entre al objetivo, se observará un campo oscuro negro. Las membranas biológicas, macromoléculas como las proteínas desvían la luz que los ilumina, permitiendo de este modo que la luz entre al objetivo y sea vista por el observador.
Microscopio de contraste de fases
En este caso la luz es retardada en ciertas zonas del condensador y acelerada para compensar en las zonas correspondientes del objetivo, por lo tanto si no hay preparación el resultado es compensado. Al haber preparación, la luz se desvía más o menos de acuerdo a la refracción. La luz retardada por el condensador en estas condiciones no pasa por la parte aceleradora del objetivo y el retardo de ella se hace evidente al observador.
Además los diferentes índices de refracción de las distintas fases de la muestra producirán diferentes desviaciones. El resultado es que la luz proveniente de la zona límite entre dos fases llega al observador con diferentes grados de retardo, produciendo zonas oscuras donde hay cambio de fases.
Microscopio de Fluorescencia
Un objetivo fluorescente es aquel que al recibir la luz de onda corta, la absorbe y emite luz de onda más larga. La mayoría de los especímenes biológicos no son fluorescentes pero puede añadirse a la preparación un marcador fluorescente. El microscopio de fluorescencia requiere dos filtros: uno que deje pasar la luz de onda corta, pero no la de onda larga, para iluminar el objeto o el marcador, y el otro que bloquea el paso de la luz de onda corta, usada para iluminar y deja pasar la luz de onda larga, emitida por el objeto.
Microscopio Electrónico
Este instrumento, permite aumentos cercanos a 1.000.000 X (mil veces el aumento del microscopio de luz), logrando visualizar átomos y moléculas. Su introducción en la década de los 50 abrió el campo de la Citología clásica a la Biología Celular actual.
El principio de este instrumento es simple, puesto que la óptica usada es la misma que la del microscopio de luz (o compuesto), usando electrones con una longitud de onda de fracciones de nanómetros. Los electrones son fáciles de producir (basta un filamento caliente como el de una ampolleta) y de acelerar para lograr una longitud de onda pequeña, pero no pasan por el aire, por ello el elemento más importante de un microscopio electrónico son sus bombas de vacío.
El microscopio electrónico de transmisión consta de una columna donde está el cañón de electrones, condensadores, objetivo, lentes intermedias, ocular – proyector y el porta muestra. Como los electrones no son visibles al ojo humano incluyen una pantalla de observación y un sistema fotográfico
A diferencia del anterior, el microscopio electrónico de barrido no posee lentes, salvo condensadores. Estos producen un haz muy fino de electrones que choca en la superficie de la muestra y se desprenden nubes de electrones secundarios. Estos, son reconocidos por un detector que asociado a un sistema generador de imágenes nos da una imagen de la superficie de la muestra.
Instrucciones básicas
Antes de observar cualquier preparación debe tener presente que el microscopio es un instrumento delicado. Debido a esto debe utilizarse tomando en cuenta algunas instrucciones básicas:
a) Coloque el microscopio en una posición cómoda sobre una superficie plana. Tómelo siempre del brazo o columna. Si desea cambiar la posición del instrumento levántelo y NO lo arrastre por la mesa.
b) Es conveniente limpiar la limpieza de los diferentes lentes antes de comenzar la observación
c) Encienda la lámpara, baje el condensador y abra el diafragma completamente.
Realización de la observación
a) Aleje el objetivo de la platina y coloque la lente de aumento menor.
Introducción
Todos los seres vivientes están constituidos por células, en algunos casos una sola célula conforma un organismo completo (unicelulares), en otros más complejos muchas células se han organizado para constituir un organismo (pluricelulares). Lo anterior ha llevado a la especialización celular para la realización de variadas funciones, producto de lo cual, es posible observar una muy amplia diversidad celular. Así por ejemplo, existen múltiples formas y tamaños celulares, como también, diferentes niveles de organización:
i)los procariontes de una organización estructural simple, no presentan compartimentos intracelulares. El DNA se encuentra disperso en el citoplasma ocupando una posición mas o menos central;
ii) los eucariontes, en cambio presentan una mayor complejidad, poseen compartimentalizaciones y han desarrollado una multiplicidad de estructuras membranosas adaptadas para realizar funciones específicas denominadas organelos. El material genético se encuentra en un compartimento denominado núcleo.
El estudio de la estructura y funciones celulares ha experimentado tres períodos fundamentales de progreso. El primer periodo se inicia a comienzos del siglo XVII y se caracteriza por el descubrimiento de un mundo diminuto, no detectable por el ojo humano pero sí por lupas o lentes. Las primeras observaciones fueron de glóbulos rojos sanguíneos por Fierre Borel en 1656. En 1665, Robert Hooke introdujo el término célula para describir la estructura del corcho y en 1674, Antón van Leeuwenhoek observó organismos unicelulares vivos. Al paso de los años, los lentes se perfeccionaron y transformaron en microscopios ópticos. En 1838-1839, Mathias Jacob Scheiden y Theodor Schwann formularon la teoría celular, que considera a la célula como una unidad estructural común de todos los seres vivientes, y que una célula madre es capaz de dividirse en dos células hijas. Esto último fue un aporte hecho por Rudolph Virchow en 1858. Ya a fines del siglo XIX se dispuso de tinción y fijación de los tejidos que permitieron una enorme recopilación de detalles celulares como la división celular y la fecundación celular. Los fenómenos de evolución y herencia empezaron a tener gran importancia. El segundo período, comienza a fines del siglo XIX y se caracteriza por la tentativa de interpretar las estructuras celulares con respecto a su función. El tercer período en cambio, acentúa el conocimiento de la función de lo componentes celulares a nivel molecular.
El microscopio es sin duda el elemento más importante para el estudio de la morfología celular. El tipo de microscopio más utilizado es el microscopio óptico, que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. El microscopio óptico más simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios ópticos pueden aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces, lo que resulta de gran utilidad considerando, por ejemplo, que una célula animal típica mide entre 10 y 20 μm de diámetro. El microscopio compuesto puede dividirse en:
i) Sistema mecánico; conformado por:
a) El pie o base de sustentación.
b) El brazo o columna.
c) La platina; que consiste en una plataforma horizontal con un orificio central por donde pasa la luz. Es aquí donde se ubica la preparación en un carro móvil que permite desplazarla.
d) El tubo; es un cilindro metálico que lleva en el extremo próximo al observador el ocular y el revólver en el extremo opuesto.
e) El revólver es una pieza giratoria que posee diferentes lentes objetivos, cada uno de ellos posee un aumento distinto. Al girar esta pieza es posible utilizar estos lentes para la observación.
f) Los tornillos de focalización; el enfoque se realiza modificado la distancia entre la preparación y el objetivo. El ajuste se realiza con dos tornillos; el macrométrico que se usa para los ajustes gruesos y el micrométrico para el ajuste fino o de precisión. Este último tiene una escala graduada, en donde cada marca representa un avance de dos micrones.
ii) Sistema óptico está compuesto por:
a) La fuente luminosa que se ubica bajo el condensador.
b) El condensador consiste en un sistema de lentes que concentra la luz en la preparación. Posee un tornillo de control que permite mover este dispositivo.
c) El diafragma o iris; se localiza en el condensador y permite regular la cantidad de luz que sale de este.
d) Anillo porta filtro; permite colocar un filtro de color anexo al condensador para destacar alguna estructura de interés en la preparación.
e) Lentes oculares; se encuentran en la parte superior del tubo, por lo general tienen un aumento de 8X, 10X ó 12X. Los oculares están formados generalmente por un sistema de dos lentes plano convexas simples o compuestas, separadas por un diafragma interno. El lente inferior se denomina "lente de campo" y tiene por función recoger la mayor cantidad de rayos divergentes que vienen del objetivo. Tiene su foco en el diafragma y ahí la imagen es aumentada por el lente superior.
f) Lentes objetivos; se encuentran montadas en el revólver que permite su intercambio durante la observación. Las diferentes lentes están marcadas con su aumento y la apertura numérica, vale decir el lente tiene la marca 10:1:AN 0.25 significa que ese objetivo tiene un aumento de 10, siendo su apertura numérica 0.25. La lupa u objetivo menor tiene un aumento de 4X, los otros generalmente son 10X, 40X y 100X.
En ocasiones también se habla de "objetivos a seco" y de "objetivos de inmersión", haciendo referencia a lo que se encuentra entre la preparación y el objetivo. Así el objetivo a seco se refiere a que entre la preparación la lente existe aire, mientras que los objetivos de inmersión requieren que exista entre la lente y la preparación una sustancia conocida como aceite de inmersión.
Microscopios especiales
Varias propiedades ópticas pueden utilizarse en combinación con un microscopio. Nos referiremos al microscopio de campo oscuro, contraste de fases, fluorescencia y al microscopio electrónico.
Microscopio de campo oscuro
Se basa en la propiedad que tienen los objetos muy pequeños del orden de la longitud de onda de la luz (o el borde de algunos objetos microscópicos tales como membranas celulares o de organelos) de dispersar la luz, o sea el rayo de luz se “quiebra” al pasar por ellos. Si iluminamos oblicuamente el objeto en tal forma que el rayo de luz no entre al objetivo, se observará un campo oscuro negro. Las membranas biológicas, macromoléculas como las proteínas desvían la luz que los ilumina, permitiendo de este modo que la luz entre al objetivo y sea vista por el observador.
Microscopio de contraste de fases
En este caso la luz es retardada en ciertas zonas del condensador y acelerada para compensar en las zonas correspondientes del objetivo, por lo tanto si no hay preparación el resultado es compensado. Al haber preparación, la luz se desvía más o menos de acuerdo a la refracción. La luz retardada por el condensador en estas condiciones no pasa por la parte aceleradora del objetivo y el retardo de ella se hace evidente al observador.
Además los diferentes índices de refracción de las distintas fases de la muestra producirán diferentes desviaciones. El resultado es que la luz proveniente de la zona límite entre dos fases llega al observador con diferentes grados de retardo, produciendo zonas oscuras donde hay cambio de fases.
Microscopio de Fluorescencia
Un objetivo fluorescente es aquel que al recibir la luz de onda corta, la absorbe y emite luz de onda más larga. La mayoría de los especímenes biológicos no son fluorescentes pero puede añadirse a la preparación un marcador fluorescente. El microscopio de fluorescencia requiere dos filtros: uno que deje pasar la luz de onda corta, pero no la de onda larga, para iluminar el objeto o el marcador, y el otro que bloquea el paso de la luz de onda corta, usada para iluminar y deja pasar la luz de onda larga, emitida por el objeto.
Microscopio Electrónico
Este instrumento, permite aumentos cercanos a 1.000.000 X (mil veces el aumento del microscopio de luz), logrando visualizar átomos y moléculas. Su introducción en la década de los 50 abrió el campo de la Citología clásica a la Biología Celular actual.
El principio de este instrumento es simple, puesto que la óptica usada es la misma que la del microscopio de luz (o compuesto), usando electrones con una longitud de onda de fracciones de nanómetros. Los electrones son fáciles de producir (basta un filamento caliente como el de una ampolleta) y de acelerar para lograr una longitud de onda pequeña, pero no pasan por el aire, por ello el elemento más importante de un microscopio electrónico son sus bombas de vacío.
El microscopio electrónico de transmisión consta de una columna donde está el cañón de electrones, condensadores, objetivo, lentes intermedias, ocular – proyector y el porta muestra. Como los electrones no son visibles al ojo humano incluyen una pantalla de observación y un sistema fotográfico
A diferencia del anterior, el microscopio electrónico de barrido no posee lentes, salvo condensadores. Estos producen un haz muy fino de electrones que choca en la superficie de la muestra y se desprenden nubes de electrones secundarios. Estos, son reconocidos por un detector que asociado a un sistema generador de imágenes nos da una imagen de la superficie de la muestra.
Instrucciones básicas
Antes de observar cualquier preparación debe tener presente que el microscopio es un instrumento delicado. Debido a esto debe utilizarse tomando en cuenta algunas instrucciones básicas:
a) Coloque el microscopio en una posición cómoda sobre una superficie plana. Tómelo siempre del brazo o columna. Si desea cambiar la posición del instrumento levántelo y NO lo arrastre por la mesa.
b) Es conveniente limpiar la limpieza de los diferentes lentes antes de comenzar la observación
c) Encienda la lámpara, baje el condensador y abra el diafragma completamente.
Realización de la observación
a) Aleje el objetivo de la platina y coloque la lente de aumento menor.
b) Seleccione la preparación que desea observar, revísela para asegurarse que esta se encuentra limpia.
c) Abra la pinza del carro, coloque la preparación con el cubreobjetos hacia arriba y cierre el carro.
d) Ajuste la posición del carro de modo que la región a observar quede justo en el orificio de la platina.
c) Abra la pinza del carro, coloque la preparación con el cubreobjetos hacia arriba y cierre el carro.
d) Ajuste la posición del carro de modo que la región a observar quede justo en el orificio de la platina.
e) Usando el macrométrico acerque la lente a la preparación. Cuando logre un foco aproximado utilice el micrométrico (gírelo lentamente) para el ajuste de precisión.
f) Si desea cambiar el aumento, gire el revólver y seleccione el nuevo objetivo a utilizar. Debiera bastar un pequeño ajuste del micrométrico para llegar a foco, si fuera necesario reajuste la iluminación usando el condensador. Si requiere usar el lente de inmersión NUNCA lo use como objetivo seco, puede rayarlo.
Uso del objetivo de inmersión
Uso del objetivo de inmersión
a) La preparación debe estar enfocada a 40X (objetivo a seco), gire el revólver de modo que el objetivo de inmersión quede en posición intermedia (40X y 100X).
b) Coloque una gota de aceite de inmersión sobre el cubre objeto.
c) Lleve el objetivo de inmersión al eje óptico.
d) Utilizando el tornillo micrométrico lleve el objeto a foco, si lo requiere modifique la cantidad de luz del condensador.
e) Cuando finalice la observación baje la platina, retire la preparación. Limpie tanto el objetivo como la preparación con un paño humedecido con Xilol.
Al finalizar las observaciones el microscopio y las preparaciones deben quedar limpios. Gire el revólver y deje la lupa como lente de observación. Apague la lámpara y enrolle el cordón en el pie del microscopio. Asegúrese de colocar el microscopio en una superficie plana (no al borde de la mesa) cubierto por su funda.
Descripción de lo observado
Debe seguir una estructura, que puede variar según el observador, pero que debe ser sistemática y ordenada. Se sugiere que considere en sus observaciones el siguiente esquema:
a) Objetivo: referido al porque se realiza la observación (Ej. observación de núcleo)
b) Material: es el órgano o tejido del que se obtuvo la preparación (Ej. riñón de rata)
c) Método: se refiere a la técnica histológica usada para elaborar la preparación (a fresco o permanente) y a la tinción utilizada. (Ej. Preparación en fresco de células de epidermis de cebolla)
d) Aumento: la amplificación del objeto observado y depende del ocular y del objetivo. Aumento = aumento del objetivo x aumento del ocular.
e) Observaciones: considere describir la forma celular; relación con otros elementos presentes, tamaño celular; forma, número y posición del núcleo y algunas características del citoplasma.
Partes de un microscopio óptico
Objetivos
- Conocer las partes del microscopio compuesto y sus funciones.
- Aprender a realizar una preparación.
- Aprender a realizar una observación utilizando el microscopio compuesto.
- Diferenciar células procariontes y eucariontes.
- Reconocer diferencias entre células animales y vegetales.
Actividades
1.- Dibuje un esquema en el que señale las diferentes partes del microscopio.
2.- Observe preparaciones que contienen letras.
3.- Realice una preparación de catáfilo de cebolla, para ello, coloque un trocito de catafilo en un portaobjetos, añada unas gotas de agua y cubra con un cubreobjetos limpio. En otro portaobjetos realice el procedimiento anterior y añada gotas de azul de metileno, deje actuar por 2 min, lave con agua cubra con un cubreobjetos limpio. ¿Qué diferencias observa en las preparaciones?
Dibuje y anote sus observaciones. Recuerde realizar las observaciones según las indicaciones de su guía. Señale el aumento, describir formas, estructuras y posición de estas.
4.- Realice una preparación de , para ello, coloque un trocito de en un portaobjetos, añada unas gotas de agua y cubra con un cubreobjetos limpio.
5.- Realice una preparación utilizando una hoja de bisturí para cortar una lámina muy fina de corcho. Colóquela en un porta objetos, añada unas gotas de agua y cubra la preparación con un cubre objetos. Realice un dibujo de lo observado y describa.
6.- Observe las preparaciones de bacterias que se le entregaran, seleccione una dibuje y descríbala en forma detallada.
7.- Observe una preparación de neurona, teñida con azul de toluidina.
8.- Observación de microfotografías.
Células epidérmicas de un catafilo (una hoja carnosa del bulbo) de cebolla (Allium cepa)
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